随着生物技术的迅猛发展,生物活性物质不断被利用,利用转基因的宿主体(原核和真核)细胞生产的活性物质作为药物已应用于临床,国内外批准上市的已逾50种,正在开发的数量达几百种其中,大部分是蛋白质和活性多肽蛋白质分子的化学结构决定其活性影响活性的因素很多,主要有两方面,一是结构因素,包括分子量大小,氨基酸组成,氨基酸序列,有无二硫键,二硫键位置,空间结构;二是蛋白质分子周围的环境因素,蛋白质!多肽受复杂的物理!化学因素影响而产生凝聚!沉淀!水解!脱酰氨基等变化国内已批准上市的基因工程药物和疫苗有20多种,大部分是冻干制剂,原因就是冻干制剂能长期保持蛋白质!多肽的活性因此,在新药的研发过程中,冻干技术是重要的一个环节。

在加入WTO后,全球一体化,市场开放,药物二次加工市场发展迅速,药物外包加工(Outsourcing)早已成为欧美制药工业的一种惯例据报道,2003年全球药物外包市场达300亿美元,2004年估计达340~350亿美元制剂外包约占整个药物外包市场的26%,其余为原料药外包加工20世纪90年代后,委托加工原料药(订单加工原料药)已被技术要求更高的/提高原料药的加工档次0所代替,即大公司将其开发的新药(原料药)交给具有很强科技实力的科研开发型公司,由后者将新药(尤其是蛋白质/多肽类药以及抗病毒药!抗癌药等等)加工成适合作为纳米级制剂!冻干粉针!口腔快溶片!气雾/干粉吸入剂,以及其他新颖给药途径的原料药这一方式成为/药物二次加工的新目标冻干针剂是其中一项重要的技术产品,如荷兰的DSM公司,它是欧洲著名的药物二次加工大企业,擅长加工抗生素原料药的冻干粉针剂2004年,投资6200万美元扩大冻干粉针剂生产能力(11台超大型冻干机,每台占地30多m2),成为欧洲最大的粉针剂生产公司加拿大的PATHEON公司是北美主要的药物二次加工企业,主营代加工冻干粉针剂该公司与意大利合作在意大利建立一个大型的冻干粉针剂生产基地,一台大型冻干装置占地271m2，可见冻干技术不但作为基因工程药物生产的一个重要环节,而且其技术的优势可以发展成为一个产业。

本文将结合基因工程的多肽和蛋白质药物的冻干针剂生产,结合本中心的中试工作,进行讨论,供同行参考。

冷冻干燥技术的原理和应用

（1）原理

冷冻干燥是指将药品在低温下冻结,然后在真空条件下升华干燥,去除冰晶,待升华结束后再进行解吸干燥,除去部分结合水的干燥方法该过程主要可分为药品准备!预冻!一次干燥(升华干燥)!二次干燥(解吸干燥)!密封保存等步骤图1所示纵坐标为气压,横坐标为温度,0℃(实际为0.001℃)为三相点,表示水以液体存在时的最低大气压,低于该点气压,水只能以冰或蒸气存在,也就是在此时升温时,水只能从冰直接变成蒸气,冷冻干燥就是远低于该气压(高真空度)下干燥水分的,通常在66~133Pa真空度和-25℃以下,才能保证冷冻干燥顺利进行。

（2）优点与缺点

冷冻干燥与其他干燥方法相比,有以下优点:

1)药液在冻干前分装,分装方便!准确!可实现连续化;

2)处理条件温和,在低温低压下干燥,有利于热敏物质保持活性,可避免高温高压下的分解变性,以实现蛋白质不会变性;

3)含水量低,冻干产品含水量一般在1%~3%,同时在真空,甚至可在通N2保护情况下干燥和保存,产品不易被氧化,有利于长途运输和长期保存;

4)产品外观优良,为多孔疏松结构且颜色基本不变,复水性好,冻干药品能迅速吸水还原成冻干前状态;

5)冻干设备封闭操作,安装环境洁净度高,减少杂菌和微粒的污染,干燥中和封装后的缺氧可起到灭菌和抑制某些细菌活力的作用。

冷冻干燥及制品的缺点和不足:

1)设备要求高,投资大,干燥速率低,干燥时间长,能耗高;

2)生物活性物质(如多肽和蛋白质药物)采用冻干制剂主要是为了保持活性,但配料(如保护剂!溶剂!缓冲剂等)选择不合理!工艺操作不合理!冻干设备选择不适当都可能在冻干制剂制备过程中失活,导致产品前功尽弃,这是生产冻干制剂的关键,需进行基础研究和针对特定产品反复试验;

3)溶剂不能随意选择,只限于水或一些冰点较高的有机溶剂,所以很难制备某种特殊的晶型,有时冻干品在复水溶解时会出现浑浊现象,这些均为开发冻干制剂所必须考虑和实验研究的。

（3）冷冻干燥技术的应用

冷冻干燥技术于1813年英国人Wallaston发明,1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素!菌种!狂犬病毒及其他生物制品进行冻干保存,取得了较好的效果在第二次世界大战中由于对血液制品的大量需求,冷冻干燥技术得到了迅速发展,进入了工业应用阶段。50年代冻干食品系统的大规模发展,促进了冻干技术和设备的进步,但由于高难度!高投入!高能耗和制造设备的落后,经历了几十年的起伏和徘徊。近20多年来,随着人们生活水平提高,对食品的品质!营养!天然无公害的观念转变,推动了冻干技术的发展,生产过程从间歇式到连续式,设备从0.1m2到上千m2形成系列,应用范围广泛:在科研方面,应用于如分析土壤中的衡量成分;去除高效液相色谱收集组分的溶剂;考古中发现的重要文物如布匹!皮革!竹简等的干燥脱水等在工业上,应用于冻干食品如蔬菜!水果!海产品!甚至鲜花等;香料及调味品如咖啡!茶及各种香料!调味料;保存营养保健成分及色香味形的方便食品(日本方便食品中50%是冻干食品);水产品最广泛!要求最严格的还是在医药和生物制品方面的应用,主要是应用于血清!菌种!基因工程药物!疫苗!天然药物及生物制品等我国生物制品规程2000版中,确定的11个重组治疗蛋白药物就有8个是冻干制剂,如重组人干扰素α1b!重组人干扰素α2b,重组人干扰素γ,重组人白介素22,重组人红细胞生成素,重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,重组链激酶。

冷干制剂的生产过程

基因工程多肽和蛋白质药物冻干制剂是通过宿主体(微生物或动物细胞)培养获得表达产品!经分离纯化得到活性物质,经过配制!过滤与分装,分装好的样品送入冷冻干燥机,进行预冻!升华!干燥,最后封口因此冻干制剂的生产过程包括药物准备!预冻!一次干燥(升华干燥)和二次干燥(解吸干燥)!密封保存等5个步骤。

对于新产品的开发,则必须通过实验来确定冻干的工艺条件,在药物准备好后,要确定药物水溶液的共熔点,共熔点对冷冻干燥很重要,因为药液是一个复杂的液体,当温度下降到某一温度时晶体开始析出,随温度下降,晶体数量增加,到最后才全部凝结,此时温度叫共凝点,若从冷冻状态升温到共凝点,融化开始,这就溶质和溶剂的共熔点。不同物质的共熔点不同,如0.85%氯化钠溶液为-21.2℃,而10%葡萄糖溶液为-27℃共熔点的测量有热分析法!电阻法和低温显微镜直接观察等方法。热分析法是基于冻结的药品在升温过程中,温度达到共熔点时会突然有个能量的吸收,用热分析仪来测定该能量吸收峰可计算得到共熔点温度;电阻法是在降温冷冻或先冷冻后升温过程中电阻突然变大或变小求得,对非离子型有机化合物其电阻变化不明显,可加入一定量的附加剂来测定冷冻干燥是在真空状态下进行,只有药液全部冻结后才能在真空下升华,否则部分液体存在时,在真空下不仅会迅速蒸发,造成液体的浓缩,使冻干产品萎缩,而且溶解在水中的气体在真空下会迅速冒出来,造成液体沸腾,甚至冒出冻干瓶外,所以冻干产品在开始升华时的温度必须低于共熔点,全部冻结。

冷冻干燥时间一般较长,为保证产品质量和缩短生产周期,必需通过反复试验来确定冻干曲线,因为冻干效果是以冻干制剂与原药液的活性保存率来衡量,而活性保存率既与冻干曲线有关,亦与药液的组成与配比有关,因此需多次反复试验才能进行优化与确定。